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制備DLIN-MC3脂質納米顆粒

更新時間:2022-08-08點擊次數:2644

制備DLIN-MC3脂質納米顆粒

  實驗目的:

  分別以DLIN-MC3為陽離子主要脂質,參照文獻方法制備包載mRNA的LNP。


  實驗原理:

  DLIN-MC3是可解離脂質,在酸性條件下可質子化形成陽離子脂質,通過靜電作用于帶負電的mRNA結合,形成載有mRNA的脂質納米顆粒(lipid nanoparticles,LNPs)。常見的制備方法有薄膜-水化法、溶劑注入法、高壓均質法和微流控法等方法,在本實驗中采用微流控法,讓脂質溶液與和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的混合,形成粒徑均一的LNP。由于脂質溶解于乙醇中,核酸溶解于酸性緩沖液中,因此需要透析去除殘余的乙醇并換液至PBS。


  實驗材料:

  DLIN-MC3、DSPC、DMG-PEG2000、冰醋酸、三水醋酸鈉


  實驗步驟:

  1、 配置脂質乙醇溶液:

    a) LNP 的成分與分子量見下表:

名稱

摩爾比%

分子量

質量

DLIN-MC3

50

642.09

130mg

DSPC

10

790.2

33mg

PEG-2000

1.5

2509.2

16mg

CHO

38.5

386.654

62mg

無水乙醇(AR)

100ml


  百分比來源于前期研究,并不一定與 onpattro 和 mRNA-1273 相同。


    b)每種成分別配置三個濃度:8 mM(約5 mg/ml)、12 mM(約7.5 mg/ml)和16 mM(約10 mg/ml)。

名稱

重量或體積

冰醋酸

8ml

三水醋酸鈉

3.2g

純化水

1000ml


  2、 計算 mRNA 濃度:

    a) 根據 N/P=6,F(xiàn)RR=3 計算所需 RNA 濃度。

    b) RNA 的堿基的平均分子量為340,每個堿基攜帶1 個磷酸,因此RNA 中的含磷量為3.1 nmol/μg.

    c) 計算氮磷比時僅計算主要脂質中的氮原子數,因此每摩爾混合脂質中含有 0.5 摩爾 N。

脂質濃度(mM)

8

12

16

N/P

6

6

6

FRR

3

3

3

RNA 濃度(μg/ul)

0.072

0.108

0.143


  3、 配置 mRNA-醋酸緩沖液:

    稱取3.2g三水醋酸鈉,8ml冰醋酸,定容于1000ml。加入相應梯度的mRNA

  4、 微流控混合:


    a. 將脂質-乙醇溶液過 0.22 μm 疏水聚四氟乙烯膜,mRNA-檸檬酸緩沖液過 0.22 μm 親水聚四氟乙烯膜,過膜后裝入微量注射器中。


    b. 以FRR=3 ,磷脂和緩沖液以0.2ml/min和0.6ml/min,通過nexstarnano1芯片,混合。


  5、 透析與儲存:

    a) 制備后放入透析管(Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL)中加入 14 ml PBS在搖床上透析,2 小時后換液,直至 18 小時后透析結束。

    b) 保存于 4℃待用。


實驗名稱:LNP 包封率測定

  實驗目的:

    對制備的 LNP 包封 mRNA 的效果進行測定


  實驗原理:

    Quant-iT™RiboGreen®RNA 試劑是一種超靈敏的熒光核酸染色劑,可檢測溶液中 1-200 ng 的核酸,這種核酸染料無法透過 LNP,因此只有游離的未被 LNP 包載的核酸可以被結合。Triton-100 作為一種表面活性劑常被用做破乳劑,使用 1%的 Triton-100 處理獲得的 LNP-mRNA 可以使包載的核酸釋放,得到總核酸量。通過計算破乳前后核酸量的差異得到載藥量,再除以總核酸量即可得到包封率,即:

包封率(%)=(破乳后定量-破乳前定量)/破乳后定量


  實驗材料:

    Quant-iT ™ RiboGreen ™ RNA   檢 測 試 劑 盒 ( Thermo  Fisher , R11490 )、 Triton ™ X-100

    (SIGMA-ALDRICH,T8787-100ML)、DEPC 水、CellCarrier-96 Ultra Microplates  ( PerkinElmer,6055308)、 LNP-mRNA


  實驗步驟:

    1. LNP 制備:

      見 LNP 制備流程。

    2. 試劑準備(詳細參見說明書):

      將 20xTE 用 DEPC 水稀釋至 1x;

      用稀釋好的 1XTE 稀釋試劑盒中的標準品,稀釋成 2 μg/mL 及 100 ng/mL 兩種終濃度;

      用 1xTE 稀釋試劑盒中的 QuantiT™ RiboGreen® Reagen,稀釋成 200 倍及 2000 倍兩種終濃度; 按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下試劑,做復孔:


High range

Low range


1. LNP 破乳

Triton-100 1xTE 稀釋到 2%,取 100 μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates,加入 1 μl 制備好的

LNP,處理 5 分鐘,加入 100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

2. LNP 游離核酸測定

CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100ul1xTE,取 1μl 制備好的 LNP 加進去,混勻,加入 100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

3. 讀板

使用 SPARK 讀取熒光強度,激發(fā)光設置為 480 nm,發(fā)射光為 520 nm

4. 數據處理

1) 標曲制備

High range

Low range

2) 樣品定量

載藥量=破乳后讀值-破乳前讀值包封率(%=載藥量/破乳后讀值




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