技術文章
TECHNICAL ARTICLES1 mRNA簡介
上個世紀九十年代,在一系列體外轉錄技術被突破的背景下,mRNA可以作為治療藥物的概念正式被提出來。隨后,由于結構簡單、安全性好,以及可以誘導機體免疫反應的特點,mRNA技術逐漸被開發(fā)為疫苗產(chǎn)品平臺。
理論上,mRNA疫苗具有眾多傳統(tǒng)疫苗不具備的優(yōu)點。首先,跟傳統(tǒng)疫苗相比較mRNA具有更強的免疫原性。mRNA可以表達特定序列的靶蛋白誘導特異性免疫反應,同時作為核酸類的免疫原,mRNA還可以誘導人體的天然免疫反應(見下文),使其擁有“自我佐劑"(self-adjuvant)的特點,兩方面的作用,使得疫苗具有更強的免疫原性;第二,在安全性方面,mRNA疫苗的遞送不需要特定的質粒載體,不進入細胞核內(nèi)部,只需要在細胞質內(nèi)瞬時表達抗原蛋白,不存在整合到人體基因組上的風險。第三,mRNA疫苗具有生產(chǎn)優(yōu)勢。在成本上mRNA疫苗的GMP生產(chǎn)成本是傳統(tǒng)疫苗的五到十分之一。另外,由于化學結構相似,生產(chǎn)和純化與抗原本身無關,同一條mRNA疫苗的生產(chǎn)線很容易被改造成符合EMA或FDA標準的不同抗原疫苗的生產(chǎn)線,因此,在應對突發(fā)傳染病時,mRNA疫苗很容易在短時間內(nèi)完成研發(fā)和生產(chǎn)。
雖然在理論上mRNA疫苗有著突出的優(yōu)點,但是目前研發(fā)最快的產(chǎn)品還處于臨床試驗階段。阻礙mRNA疫苗技術發(fā)展的zui大障礙是其對先天性免疫的激活,這種免疫反應對mRNA疫苗來說是一把劍。一方面mRNA通過免疫激活來誘導機體的免疫保護,另一方面過度的激活先天性免疫可以阻止mRNA的翻譯,并降解mRNA(見下文)。從成藥性的角度來看,一款合格的mRNA疫苗產(chǎn)品要求其mRNA結構足夠穩(wěn)定,能夠在靶細胞中遞送和表達并誘發(fā)預期的適應性免疫反應。
2 mRNA誘導的先天性免疫反應
先天性免疫是人體免疫系統(tǒng)的第一道防線,可以通過模式識別受體(Pattern Recognition Receptor,PRR)識別入侵抗原的病原相關模式分子(Pathogen-Associated Molecular Patterns,PAMP),然后通過一系列復雜的細胞內(nèi)部級聯(lián)反應進行免疫應答。mRNA疫苗作為外源的核酸物質,進入體內(nèi)后會被一系列位于細胞表面、內(nèi)質網(wǎng)以及細胞質中的模式識別受體識別,并激發(fā)機體的先天性免疫應答,正如上文所述,這種免疫應答是一把“劍"。
研究發(fā)現(xiàn),mRNA疫苗誘導的先天性免疫反應可以促進人體樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)的成熟。成熟的DC進一步向人體的免疫系統(tǒng)遞呈mRNA表達的靶抗原,誘導機體產(chǎn)生特異的T細胞和B細胞免疫,對人體產(chǎn)生預期的免疫保護效應。從這個角度看,mRNA誘導的先天性免疫反應是有利的。
mRNA疫苗作為一種單鏈RNA其本身也是一種PRR,其單鏈結構和代謝產(chǎn)物可以激活細胞內(nèi)的Toll樣受體7(TLR-7)和Toll樣受體8(TLR-8),并最終激活I型干擾素介導的先天性免疫反應,最終阻止mRNA表達并降解mRNA。另外,在體外進行mRNA合成的過程中會產(chǎn)生雙鏈RNA(double-strand RNA,dsRNA)。dsRNA也是一種常見的的核酸類PAMP,污染了dsRNA的mRNA產(chǎn)品可以上調(diào)并激活蛋白激酶R和寡聚腺苷酸合成酶,隨后通過I型干擾素介導的免疫反應阻止mRNA的翻譯及降解mRNA。從這個角度來看,mRNA誘導的先天性免疫反應對產(chǎn)品本身有損害作用。這種有害的免疫反應可以通過調(diào)節(jié)mRNA的核酸序列,在純化階段采用先進工藝去除dsRNA等手段避免。
mRNA介導的先天性免疫反應
3 mRNA的結構及優(yōu)化策略
3.1 mRNA加帽
真核細胞mRNA的5'端有一個帽子結構,它是在mRNA轉錄后,由甲基化的鳥苷酸(m7G)經(jīng)焦磷酸化與mRNA的5'端核苷酸相連。5'端帽子結構在mRNA許多生物學功能中起到重要的作用,這包括:mRNA的剪切、穩(wěn)定、轉運和核糖體的募集等。由于5'端帽子結構的重要生物學功能,在mRNA疫苗研發(fā)過程中需要優(yōu)化5'端帽子結構,并利用合適的工藝對mRNA原料進行“加帽"。
mRNA疫苗產(chǎn)品的加帽可以在mRNA的體外轉錄過程中通過摻入“帽子序列"實現(xiàn),這種加帽技術會將加帽序列反向加在mRNA上,這會導致約1/3的加帽失敗。通過摻入特殊的帽子結構——“anti-reverse"帽子結構(ARCA)可以降低這種反向加帽失誤的出現(xiàn)。另外,還可以先合成不帶帽子結構的mRNA,再利用痘病毒的“加帽復合物"對mRNA進行加帽,這也是一種mRNA的加帽手段。
3.2 非翻譯區(qū)序列(UTRs)修飾
在mRNA的編碼區(qū)兩端各存在一段非翻譯區(qū)(UTRs),在5'端的被稱為5'端UTR,在3'端的被稱為3'端UTR。
非翻譯區(qū)序列不是密碼子,不能翻譯成氨基酸,但是可以通過RNA結合蛋白控制mRNA產(chǎn)品的降解和轉錄效率。因此,每一種mRNA疫苗都需要考慮如何設計產(chǎn)品的UTR組件,進而提高在目的細胞中mRNA疫苗的穩(wěn)定性和轉錄效率。大量的研究發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾和人源的α-球蛋白/β-球蛋白的UTR序列非常穩(wěn)定,而且能夠增加異源的mRNA的表達效率,因此這兩個蛋白的UTR原件通常被設計為mRNA疫苗的UTR組件。當然,也有其它蛋白的UTRs被研究用于mRNA疫苗的組件,在此不再贅述。
3.3 Poly(A)
大多數(shù)真核生物的mRNA 的3'端都有由100~200個腺苷酸聚合形成的Poly(A)尾巴。mRNA的Poly(A)尾巴可以和5'端帽子結構共同合作,增強mRNA結構的穩(wěn)定性。Poly(A)尾巴首先和大量的Poly(A)結合蛋白(PABP)結合,然后募集真核生物起始因子4G(eIF4G),增加Poly(A)跟5'端帽子結構的親和力,最終mRNA的Poly(A)尾巴和5'端帽子結構首尾相接,形成環(huán)裝mRNA。環(huán)裝mRNA結構有利于核糖體的募集,其特殊的結構也能保護mRNA不被降解。
在mRNA體外合成過程中,Poly(A)尾巴可以通過質粒DNA模板轉錄獲得,也可以先合成mRNA再通過Poly(A)聚合酶加上不同單位數(shù)量的尾巴。前者能夠在mRNA產(chǎn)品中加入特定數(shù)目的Poly(A),而后者加入的單位數(shù)不確定。
Poly(A)尾巴的單位數(shù)目對于其生物學作用起到了至關重要的作用。在哺乳動物細胞內(nèi),活躍表達的mRNA包含的Poly(A)序列的長度為100-250個。有研究發(fā)現(xiàn),表達效率越高的mRNA,其Poly(A)尾巴越短。但是當Poly(A)單位長度小于12時,mRNA結構就不再穩(wěn)定,容易被降解。在設計mRNA疫苗產(chǎn)品的序列時,Poly(A)的長度也是非常重要的優(yōu)化指標。
3.4 開放閱讀框
開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)包涵了mRNA的全部編碼序列,負責進入人體后表達mRNA運載的抗原靶蛋白。
密碼子水平的修飾,利用常用的密碼子,選用tRNA較多的密碼子;使各個密碼子的比例更接近靶物種或者細胞的比例;
GC含量的修飾,避免復雜二級結構形成;二級結構對mRNA的延伸和轉錄非常重要,高穩(wěn)定的二級結構和發(fā)夾結構需要避免。這樣的二級結構可以阻止核糖體的進入、掃描以及容易被先天性免疫識別為PAMP。
4 mRNA疫苗分類
mRNA疫苗包括兩類:自我擴增型(self-amplifying or replicon)以及非復制型(non-replicating or synthetic)的mRNA疫苗。
mRNA疫苗的兩種類型
自我擴增型mRNA疫苗的設計通常是基于甲病毒屬(alphavirus)的病毒基因組。甲病毒屬為感染昆蟲的RNA病毒,用編碼抗原蛋白的mRNA代替甲病毒基因組上的甲病毒結構蛋白RNA,保留了甲病毒基因組自我復制的能力,又不能合成甲病毒蛋白。這類改造后的甲病毒基因組進入體內(nèi)后可以自我復制產(chǎn)生編碼抗原蛋白的mRNA,很少的量就可以引起較強的免疫反應。
非復制型RNA疫苗則是在體外轉錄好的一段編碼抗原蛋白的完整mRNA,包括5?和3?的未翻譯區(qū)(UTRs),poly A tail用于穩(wěn)定mRNA和促進轉錄;同時mRNA還有多種堿基修飾來提高mRNA的穩(wěn)定性,zui后利用納米脂質體等遞送技術將mRNA遞送至細胞內(nèi),從而翻譯抗原蛋白,引發(fā)免疫反應,但是這種合成的mRNA在人體內(nèi)無法自我復制。
參考文獻
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